人淋巴細(xì)胞分離液操作protocal

Lymphocyte Separation Medium（human, Ficoll-Paque ）是一種無菌的、即用型的Ficoll-泛影酸鈉，能夠簡單快速的從少量或大量的人外周血、骨髓和臍帶血中高產(chǎn)和高純度的提純淋巴細(xì)胞的一種即用型密度梯度介質(zhì)。Ficoll-Paque PLUS內(nèi)毒素水平非常低，小于0.12EU/ML，分離所得的細(xì)胞中95%左右為單個核細(xì)胞，細(xì)胞存活率大于90%，回收率為60%左右。

# 操作 Protocol #

一.試劑準(zhǔn)備

1.樣本體積: 4 ml（總） 

2.鹽緩沖液（可用PBS或生理鹽水）

A液配制

加950ml的蒸餾水溶解，用10 N HCl調(diào)節(jié)PH至7.6，zui后定容至1L。

B液配制

1體積的鹽緩沖液：取1體積的A溶液與9體積的B容液混合，每次操作至少需要 20 ml /次

★每次實(shí)驗(yàn)需新鮮配置（可4℃保存一個星期）

二．分離步驟 

1.使用前上下顛倒數(shù)次確保淋巴細(xì)胞分離液充分混合 

2. 打開瓶蓋，用移液管或注射器取淋巴細(xì)胞分離液 (4ml) 至離心管. 

3. 取稀釋后的血液樣本（4ml）加入到離心管中 (Fig 1)     V(血液：鹽緩沖液：淋巴細(xì)胞分離液)=1：1：2

注意：輕輕加入樣本形成分層，避免和淋巴細(xì)胞分離液混合

4.將離心管在18–20 °C，400g 離心 30-40 min

5. 輕輕移除上層分離液（血漿）

注：輕輕操作，避免淋巴細(xì)胞層和上層分離液混合

洗滌淋巴細(xì)胞以去除血小板操作步驟：

1. 吸取淋巴細(xì)胞層至干凈的離心管，盡量減少吸取上下分層液的量（淋巴細(xì)胞分離液層會引起粒細(xì)胞污染；血漿層會引起血小板和血漿蛋白的污染）

2. 向離心管中加入至少3體積（6ml）的鹽緩沖液

3. 使用巴斯德吸管輕輕吹打使淋巴細(xì)胞層與鹽緩沖液充分混合

4. 使離心管在18–20 °C在60–100 g 離心 10分鐘

5. 去除上層分離液

6. 再向離心管中添加6-8ml的鹽緩沖液，用巴斯德吸管輕輕吹打使淋巴細(xì)胞與其充分混合

7. 18–20 °C，60–100 g 離心 10 minutes

8. 去除上層分離液即可.

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