基因的編輯調(diào)控技術(shù)—轉(zhuǎn)染，您了解多少？

轉(zhuǎn)染——是將外源基因如DNA、RNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。是真核細(xì)胞在一定條件下主動(dòng)或被動(dòng)導(dǎo)入外源基因而獲得新的表型的過(guò)程。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、基因表達(dá)調(diào)控、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等領(lǐng)域中，轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

圖1 轉(zhuǎn)染

根據(jù)外源性基因在真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)間的長(zhǎng)短我們可將轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩種。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，外源基因得以表達(dá)但它們并不會(huì)整合到細(xì)胞的基因組中，也就不會(huì)被復(fù)制，適用的核酸類型主要包括質(zhì)粒DNA、siRNA、miRNA和mRNA。細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的外源基因表達(dá)時(shí)間有限，通常僅持續(xù)幾天，直到外源基因在細(xì)胞分裂過(guò)程中因各種因素丟失為止。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是建立在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上的，先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，再對(duì)得到的細(xì)胞進(jìn)行篩選，在少數(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，外源基因能夠整合到細(xì)胞的基因組中。適用的核酸類型只有質(zhì)粒DNA，且外源基因成為細(xì)胞基因組的一部分從而得以復(fù)制，這就是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的標(biāo)志。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的子代細(xì)胞也同樣表達(dá)外源基因，由此形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。

圖2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的區(qū)別

1．化學(xué)介導(dǎo)法

主要是使用載體分子去中和或者使帶負(fù)電的核酸帶正電荷，讓核酸更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。主要包括DEAE-葡聚糖法、磷酸鈣法、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法、陽(yáng)離子聚合物法等。

2．物理介導(dǎo)法

物理介導(dǎo)法是將核酸直接遞送到細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。主要包括電轉(zhuǎn)染、顯微注射法、基因槍法。

3．生物介導(dǎo)法

又稱之為病毒介導(dǎo)法，是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。病毒介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染效率很高，尤其是針對(duì)難轉(zhuǎn)染的活體細(xì)胞、原代細(xì)胞。主要包括慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等病毒介導(dǎo)法。

圖6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染的途徑

圖7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染流程圖

以質(zhì)粒DNA為例介紹細(xì)胞轉(zhuǎn)染的流程(24孔板、貼壁細(xì)胞、核酸轉(zhuǎn)染試劑盒(貨號(hào)：abs60259))：

1.1儀器設(shè)備

CO₂培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、水浴鍋、醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱、移液器(一套)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀等。

1.2試劑耗材
DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、磷酸緩沖溶液(PBS)、胰酶、核酸轉(zhuǎn)染試劑盒(abs60259)、24孔板、1.5ml無(wú)菌離心管若干等。

Step1 細(xì)胞接種:

1．轉(zhuǎn)染前一天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)接，每孔接種1.5-2.0×10⁵個(gè)細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為90%左右，且生長(zhǎng)良好(非常重要)；

2．最好在轉(zhuǎn)染開(kāi)始之前更換新鮮的含血清培養(yǎng)基，以防轉(zhuǎn)染后孵育階段細(xì)胞密度太大、營(yíng)養(yǎng)不足導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

Step2 試劑A/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備(該步完成后應(yīng)立即進(jìn)行轉(zhuǎn)染):

1．在1.5 ml無(wú)菌離心管A中加入50µl無(wú)血清培養(yǎng)基，再加入適量的轉(zhuǎn)染試劑A，見(jiàn)下表8。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

2．在1.5 ml無(wú)菌離心管B中加入50µl無(wú)血清培養(yǎng)基，并加入適量的試劑B，輕輕混勻，再加入適量的DNA，見(jiàn)下表8。用移液器再次輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

3．將DNA-培養(yǎng)基混合物滴加至試劑A-培養(yǎng)基混合物中，用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15~20分鐘后，立即轉(zhuǎn)染。

注意： 1. 試劑A-培養(yǎng)基混合物和DNA-培養(yǎng)基混合物的混合次序非常重要，切勿顛倒。

  2. 離心管最好使用聚丙烯離心管。

Step3 轉(zhuǎn)染:

1．將Step2制備的轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加至培養(yǎng)基中，邊加邊輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板以使復(fù)合物均勻分布。加完后，立即將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

2．培養(yǎng)12小時(shí)后即可觀察，最佳觀察或收獲時(shí)間為24~48小時(shí)。

3．試劑A在培養(yǎng)基中仍有較高的轉(zhuǎn)染效率，因此轉(zhuǎn)染前后不需要換成無(wú)血清或低血清培養(yǎng)基。

表8 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同培養(yǎng)體系推薦初始轉(zhuǎn)染條件

細(xì)胞密度對(duì)轉(zhuǎn)染效率有一定的影響。不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時(shí)的最適細(xì)胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會(huì)因不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。轉(zhuǎn)染時(shí)過(guò)高或者過(guò)低的細(xì)胞密度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達(dá)水平偏低。因此如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并為以后的實(shí)驗(yàn)建立一個(gè)穩(wěn)定方法，包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等。陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑具有微量的細(xì)胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細(xì)胞數(shù)，有的要求細(xì)胞達(dá)到90%匯合度；而研究細(xì)胞周期等表達(dá)周期長(zhǎng)的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的試劑。一般轉(zhuǎn)染時(shí)貼壁細(xì)胞密度大致為50%-90%，但這個(gè)需要參考所選轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)。

這點(diǎn)非常關(guān)鍵，很多時(shí)候傳代次數(shù)太少或者太多都將導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染試劑敏感度的改變。因此，為了提高轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性、降低細(xì)胞毒性，應(yīng)盡量使用適度傳代、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過(guò)幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,最容易轉(zhuǎn)染。

不同細(xì)胞種類的細(xì)胞在做轉(zhuǎn)染時(shí)轉(zhuǎn)染效率通常不同，因此所需要的轉(zhuǎn)染體系是不同的，不能一種轉(zhuǎn)染體系用在所有類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都有不同的轉(zhuǎn)染方法，但大都大同小異，同時(shí)目前產(chǎn)品都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，通過(guò)這些資料可選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑。另外，在大規(guī)模使用前，仍需進(jìn)行轉(zhuǎn)染試劑和核酸比例的實(shí)踐摸索。

用于轉(zhuǎn)染的核酸類型一般有質(zhì)粒DNA、mRNA 、sirNA和miRNA，針對(duì)不同的核酸一般采用不同的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方法。另外在制備高純度DNA時(shí)，還需要對(duì)DNA進(jìn)行內(nèi)毒素的去除，內(nèi)毒素的存在會(huì)造成細(xì)胞毒性，嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染的效果影響也非常大，一般轉(zhuǎn)染技術(shù)是基于電荷吸引原理，如果DNA不純，帶有污染物都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的的形成。

圖9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染圖

轉(zhuǎn)染類產(chǎn)品推薦

細(xì)胞培養(yǎng)類產(chǎn)品推薦