類器官培養(yǎng)常見問題匯總

Q1：類器官和腫瘤球有什么區(qū)別？

A1：類器官中多種不同類型的細(xì)胞，可以在體外自我分化自我組裝，具有干性可以進(jìn)行傳代；腫瘤球只有單一細(xì)胞。

Q2：如何避免原代培養(yǎng)中的污染問題？

A2：動物源性的樣本一般比人源的更容易污染，尤其是一些胃腸、泌尿系統(tǒng)，培養(yǎng)過程可以添加一些慶大霉素或者抗生素。

Q3：藥篩常用的指標(biāo)有哪些？

A3：一般IC50用的比較多。

Q4：為什么類器官不會缺少營養(yǎng)？是因為長在基質(zhì)膠里嗎？

A4：因為類器官中有多種細(xì)胞類型，并且是一個腔狀的結(jié)構(gòu)，所以不會吸收不到營養(yǎng)。

Q5：組織來源的類器官和ipsc的有什么區(qū)別？組織的大小和體積有什么要求嗎？

A5：組織的大小建議黃豆大??；IPS主要是干細(xì)胞誘導(dǎo)的，周期比較長，優(yōu)點(diǎn)在于純度比較高，但是一般不能傳代。

Q6：類器官和腫瘤球哪個在藥篩中使用更廣泛？

A6：類器官做藥篩是目前的一個新的趨勢，后續(xù)應(yīng)用會更廣泛一些。

Q7：類器官培養(yǎng)到什么時候可以加藥？

A7：一般建議是長到200-300um可以加藥，傳代的第2代或者第3代。

Q8：IC50與臨床用藥濃度有什么聯(lián)系？IC50的用途

A8：IC50 主要是對藥物敏感性的判斷，與用藥的濃度是有一定關(guān)系的。

Q9：類器官藥篩中是如何選擇藥物的？濃度范圍多大？

A9：舉例：如果是檢測化合物，化合物中都有IC50值，我們直接擴(kuò)大1000倍。

Q10：PBMC和類器官共培養(yǎng)還需要添加基質(zhì)膠嗎？

A10：可以加基質(zhì)膠，也可以不加。

Q11：藥篩怎么做正常組織類器官對照？

A11：用DMSO做對照即可。

Q12：類器官培養(yǎng)凍存后一般可以傳幾代？凍存需要有特殊的細(xì)胞凍存液嗎？

A12：主要看類器官的干性，干性比較好可以傳20代以上；凍存液需要類器官專用的無血清凍存液。

Q13：類器官培養(yǎng)2-3天直徑可以達(dá)到多少？

A13：主要看類器官生長的情況，一般是100-200um.如果類器官初始體積就比較大，直徑會更大一些。

Q14：組織養(yǎng)成的類器官多次傳代，可以用于提出腫瘤原代細(xì)胞嗎？

A14：原理上是可以的，把基質(zhì)膠鋪薄一些讓其貼壁，再把培養(yǎng)基換成常規(guī)血清培養(yǎng)基。

Q15：組織提取的原代細(xì)胞只能傳代3-5次，為什么類器官可以傳很多次？

A15：因為原代細(xì)胞是單一細(xì)胞系，一些增殖的基因會起到抑制作用，但是類器官中是有干細(xì)胞的，每一代的類器官中都有一些具有干性的原代祖細(xì)胞，所以可以一直傳代，而且類器官的培養(yǎng)基可以保持細(xì)胞干性，抑制其分化能力。

Q16：加藥后如何判斷藥物敏感性？用哪些方法檢測？

A16：一種是觀察明場圖片，另外就是終點(diǎn)法，像比較常見的CCK8、ATP細(xì)胞活性檢測、活死染色法也可以。

Q17：檢測IC50一般采取什么方法？

A17：比較常見的是CCK8檢測、ATP細(xì)胞活性檢測、活死染色法。

Q18：做實驗選用第幾代的類器官比較好？

A18：建議3-5代是比較好的。

Q19：類器官怎么計數(shù)？

A19：常規(guī)顯微鏡4倍鏡下進(jìn)行計數(shù)即可；另外可以用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)。

Q20：類器官直徑多大是可以加藥？第幾天可以測ATP

A20：200-300um;建議是在加藥后120小時以上。

Q21：老鼠人源腫瘤肺轉(zhuǎn)移模型可以做類器官嗎？

A21：這種屬于腫瘤球構(gòu)建。

Q22：類器官傳代怎么消化？

A22：有專用的類器官消化液，還可以借助一些機(jī)械的消化手段，一般是1-2min,千萬不要用胰酶消化。

Q23：原代消化建議多長時間？

A23：用我們愛必信的消化液是10-15min,常規(guī)文獻(xiàn)中的要根據(jù)不同組織類型去判斷。

Q24：類器官可以分泌外泌體嗎?

A24：可以的，但是純度是不一樣的。

Q25：很多藥物對類器官的滲透深度有限，如何保證可以進(jìn)入到200- 300um深層的位置？后續(xù)染色pi染色可以滲透到最內(nèi)的深度嗎？

A25：藥物并一定要滲入到深層，作用一部分的就會起作用，因為類器官之間是相互作用的，這一點(diǎn)區(qū)別于腫瘤球，主要是腫瘤球中間是沒有縫隙的。

Q26：不同器官來源的類器官形態(tài)差別大嗎? 都是腔狀結(jié)構(gòu)嗎?

A26：差別比較大的，每個類器官的形態(tài)都是有一定的區(qū)別。

Q27：加藥后展示變化明場圖片一般時間間隔多久要拍一次？

A27：建議每2天拍一次，培養(yǎng)過程多進(jìn)行觀察，有條件可以每日觀察。

Q28：如何在藥篩過程中保持孔間一致性？

A28：每個孔建議是50個類器官，因為類器官沒有辦法計數(shù)，所以每個孔多少還是會有差距。

Q29：類器官可以直接在基質(zhì)膠里染色嗎？

A29：不建議這樣操作，建議把類器官懸浮在緩沖液或者培養(yǎng)基中進(jìn)行染色。

Q30：肺癌類器官一開始是腔狀的，后面越長越實是正常的嗎？

A30：是正常的。因為肺在長過程是會有一個M1型到M2型的轉(zhuǎn)化的。

Q31：離心提高到300g下不來如何處理?

A31：不同廠家離心力不同，提議自己摸索實驗室轉(zhuǎn)速，適當(dāng)提高。