免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之?dāng)U增&培養(yǎng)（四）

概述

免疫細(xì)胞培養(yǎng)的六個(gè)基本流程：樣本制備、細(xì)胞分選、分型鑒定、擴(kuò)增&培養(yǎng)、質(zhì)量?jī)?yōu)化、后續(xù)研究。小愛已經(jīng)給大家詳細(xì)介紹了《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之樣本制備（一）》和《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之細(xì)胞分選（二）》，《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之分型鑒定（三）》今天我們繼續(xù)一起學(xué)習(xí)擴(kuò)增&培養(yǎng)的相關(guān)知識(shí)。

從樣本制備到細(xì)胞分選、分型鑒定，我們終于獲得了純度高、活性好的目的細(xì)胞之后，便需要在體外人工模擬其在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，同時(shí)保證無菌、適宜的溫度和pH，給予免疫細(xì)胞充足的營(yíng)養(yǎng)使其不斷生長(zhǎng)繁殖，這個(gè)過程便是擴(kuò)增&培養(yǎng)，主要可分為培養(yǎng)體系建立、傳代流程、凍存和復(fù)蘇。

擴(kuò)增&培養(yǎng)

1、培養(yǎng)體系建立：

不同免疫細(xì)胞涉及的細(xì)胞因子、激活信號(hào)大不相同，因此培養(yǎng)體系也不可同一而論；同一免疫細(xì)胞不同來源（如PBMC來源、臍帶血來源、iPSCs或ESCs）的具體培養(yǎng)方案也存在差別。小愛列舉了一些免疫細(xì)胞的培養(yǎng)體系以作參考，大家可以針對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行摸索和優(yōu)化，以獲得擴(kuò)增效率高、細(xì)胞純度高、活性好的最佳培養(yǎng)方案。

（1）T細(xì)胞(human)的活化、增殖培養(yǎng)與分化：

T細(xì)胞的激活涉及到兩個(gè)信號(hào)：TCR/CD3與APC表面特異的MHC-多肽復(fù)合物結(jié)合產(chǎn)生的特異性抗原刺激信號(hào)；APC表面多對(duì)共刺激分子和T細(xì)胞相應(yīng)受體作用后產(chǎn)生的非特異性的共刺激信號(hào)。最常見的用于T細(xì)胞體外活化的是Anti-CD3和Anti-CD28，在兩者的協(xié)同作用下，可使T細(xì)胞充分活化^[1]。此外，我們還需添加不同的細(xì)胞因子以誘導(dǎo)T細(xì)胞向不同的方向分化（圖1）。

圖1 細(xì)胞因子在T細(xì)胞中的調(diào)節(jié)和功能^[2]

1.將免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(abs9772)恢復(fù)至室溫，重懸分離后的T細(xì)胞，加入CD3/CD28磁珠(abs160019)（與細(xì)胞數(shù)量1:1），1%雙抗(abs9244)，促進(jìn)T細(xì)胞活化和增殖；

2.加入300U/mL IL-2(abs04045)使其分化和增殖為效應(yīng)T細(xì)胞；或5ng/mL IL-15促使T細(xì)胞分化和增殖為記憶T細(xì)胞^[3]。

以上是一篇文獻(xiàn)的T細(xì)胞分化方案，小愛也匯總了體外誘導(dǎo)T細(xì)胞分化的一些細(xì)胞因子（圖2），可供大家參考。

圖2 體外誘導(dǎo)T細(xì)胞分化方案^[4]

Tips：原代T細(xì)胞一般在體外的培養(yǎng)時(shí)間不超過三周，用于功能實(shí)驗(yàn)的T細(xì)胞建議培養(yǎng)時(shí)間在14天以內(nèi)。

（2）PBMC(human)來源的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增^[5]：

1.調(diào)整分離后的NK細(xì)胞密度為1*10⁶cells/mL，重懸至含有免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(abs9772)中；

2.加入200U/mLIL-2，10ng/mL IL-15和1*10⁶cells/mL的K562細(xì)胞（絲裂mei素處理滅活）。在15天的擴(kuò)增過程中，每隔2-3天對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行一次傳代，補(bǔ)充細(xì)胞因子和新鮮制備的K562細(xì)胞。

當(dāng)然，PBMC(human)來源的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法有很多：細(xì)胞因子?抗體融合、飼養(yǎng)細(xì)胞或膜顆粒。小愛也找到一篇24.1分的綜述，詳細(xì)列舉了不同擴(kuò)增方案的培養(yǎng)基、添加物、培養(yǎng)天數(shù)、擴(kuò)增效率、細(xì)胞純度，大家可以按需保存！

圖2 PBMC(human)來源的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增方案^[6]

（3）單核細(xì)胞(human)的培養(yǎng)以及誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞^[7]：

1.向免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(abs9772) 加入1%雙抗(abs9244)，10%胎牛血清優(yōu)級(jí)(abs972)，使用上述培養(yǎng)基將分離的單核細(xì)胞重懸，細(xì)胞密度為1x10⁶cells/mL，放入37°C、5%CO₂的培養(yǎng)箱中，等待1h左右使細(xì)胞貼壁；

2.單核細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后即開始分化為廣義M0巨噬細(xì)胞。接種后第三天，更換新鮮培養(yǎng)基并加入25ng/mL粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，以促進(jìn)M1表型，或50ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，以促進(jìn)M2表型。第六天，可再次更換新鮮培養(yǎng)基并加入100ng/mL LPS和20ng/mL IFN-γ，使細(xì)胞極化為M1-巨噬細(xì)胞表型，或加入10ng/mL M-CSF和20ng/mL IL-4；繼續(xù)培養(yǎng)24h即可。

（4）樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)^[8]：

1.樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)一般不增殖，可在培養(yǎng)環(huán)境中存活1周或更長(zhǎng)時(shí)間。如果細(xì)胞需要持續(xù)培養(yǎng)超過一夜，建議在免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(abs9772)添加500U/mL GM-CSF和500U/mL IL4，以確保維持DC表型。

2.樹突狀細(xì)胞在10ng/mL TNF-α、5ng/mL IL-1β、15ng/mL IL-6和10ug/mL前列腺素E2(Prostaglandin E2)或0.2U/mL肝素(Heparin)和50μg/mL血藍(lán)蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)或0.2U/mL肝素(Heparin)中可分化為成熟的樹突狀細(xì)胞。

2、傳代流程

貼壁性好的免疫細(xì)胞

半貼壁性細(xì)胞和懸浮細(xì)胞

3、凍存與復(fù)蘇^[9]：

（1）凍存：在細(xì)胞密度達(dá)到10⁷cells/mL時(shí)可進(jìn)行凍存，采用分步冷凍法。具體步驟如下：

1.懸浮細(xì)胞500g室溫離心10min收集細(xì)胞沉淀，貼壁細(xì)胞胰酶消化并終止后離心收集；

2.棄上清，凍存液重懸細(xì)胞沉淀，1mL分裝并做好標(biāo)記；

3.將凍存管放置-20℃ 1h；-80℃過夜；轉(zhuǎn)移至液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

（2）復(fù)蘇：

1.從液氮中取出細(xì)胞，37℃水浴快速解凍細(xì)胞；

2.將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有12mL培養(yǎng)基的15mL離心管中；

3.500g室溫離心5min，棄上清；

4.加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的培養(yǎng)。

Tips：復(fù)蘇的免疫細(xì)胞建議通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，并通過臺(tái)盼藍(lán)染料測(cè)定細(xì)胞活力。

今天講解就到這了，下一個(gè)質(zhì)量?jī)?yōu)化，我們不見不散呀！大家如有細(xì)胞培養(yǎng)問題，歡迎一起交流哦！

參考文獻(xiàn)：

[1] Gunnlaugsdottir, B., Anti-CD28-induced co-stimulation and TCR avidity regulates the differential effect of TGF- 1 on CD4+ and CD8+ naive human T-cells.International Immunology, 2004. 17(1): p. 35-44.

[2] Dong, C., Cytokine Regulation and Function in T Cells.Annual Review of Immunology, 2021. 39(1): p. 51-76.

[3] Nguyen, D.N., et al., Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.Nature Biotechnology, 2019. 38(1): p. 44-49.

[4] Sekiya, T. and A. Yoshimura, In Vitro Th Differentiation Protocol, in TGF-β Signaling. 2016. p. 183-191.

[5] Li, F., et al., CCL5-armed oncolytic virus augments CCR5-engineered NK cell infiltration and antitumor efficiency.Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2020. 8(1).

[6] Fang, F., et al., Advances in NK cell production.Cellular & Molecular Immunology, 2022. 19(4): p. 460-481.

[7] K. Plaisance-Bonstaff, C.F., D. Wyczechowska, et al., Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes.J Vis Exp, 2019(154): p. 10.3791/59967.

[8] Boudewijns, S., et al., Autologous monocyte-derived DC vaccination combined with cisplatin in stage III and IV melanoma patients: a prospective, randomized phase 2 trial.Cancer Immunology, Immunotherapy, 2020. 69(3): p. 477-488.

[9] Raulf, M., T Cell: Primary Culture from Peripheral Blood, in Allergy. 2019. p. 17-31.

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