病理染色的成敗關(guān)鍵！樣本前處理核心技巧與避坑指南

病理染色是疾病診斷和科研的重要環(huán)節(jié)，樣本前處理的規(guī)范性直接影響染色質(zhì)量和結(jié)果準(zhǔn)確性。本文針對(duì)三種常用切片技術(shù)（固定組織冰凍切片、新鮮組織冰凍切片、石蠟切片）的前處理步驟進(jìn)行詳細(xì)解析，為科研和臨床提供參考。

一、固定組織冰凍切片

適用場(chǎng)景：需長(zhǎng)期保存或特定抗原保存的樣本。

步驟詳解：

固定：
組織離體后立即浸入4%多聚甲醛或10%中性福爾馬林，固定時(shí)間根據(jù)組織大小調(diào)整（通常10-20分鐘至24小時(shí)）。短時(shí)間固定適用于小樣本，而大塊組織需延長(zhǎng)至24小時(shí)以充分凝固蛋白結(jié)構(gòu)。

梯度蔗糖脫水：
固定后依次浸入15%→30%蔗糖溶液（PBS配制），每濃度靜置過(guò)夜至組織沉底。蔗糖滲透脫水可減少冰晶形成，維持細(xì)胞形態(tài)。

OCT包埋與切片：
脫水后組織置于冰凍切片機(jī)冷臺(tái)，滴加OCT包埋劑完quan覆蓋，-20℃速凍10-20分鐘。包埋后修塊，調(diào)整切片厚度（通常8-10μm），貼片后室溫晾干備用。

后固定與通透：
干燥切片浸入4%多聚甲醛（4℃）固定10分鐘，PBS沖洗后，以0.1% Triton X-100通透5分鐘，增強(qiáng)抗體滲透。

二、新鮮組織冰凍切片

適用場(chǎng)景：術(shù)中快速病理診斷或保存脂類/酶活性。

步驟詳解

速凍與包埋：
新鮮組織離體后直接置于冰凍切片機(jī)冷臺(tái)，滴加OCT包埋劑速凍10分鐘。若需暫存，可液氮速凍后-80℃保存。

切片與干燥：
調(diào)整切片厚度（8-10μm），貼片后室溫干燥30分鐘，使切片緊密附著載玻片。

后固定與通透：
干燥切片浸入4%多聚甲醛（4℃）固定10分鐘，PBS沖洗后，以0.1% Triton X-100通透5分鐘，增強(qiáng)抗體滲透。

三、石蠟切片

適用場(chǎng)景：高分辨率組織結(jié)構(gòu)觀察及長(zhǎng)期存檔。

步驟詳解：

固定：
組織切為3-5mm薄塊，4%多聚甲醛固定12-24小時(shí)。大標(biāo)本（如腫瘤）需延長(zhǎng)至24小時(shí)以充分滲透。

脫水與透明：
梯度乙醇（70%→100%）逐級(jí)脫水，每級(jí)1-2小時(shí)；二甲苯透明2次（各15-30分鐘），置換乙醇便于石蠟浸潤(rùn)。

浸蠟與包埋：
熔融石蠟（60℃）浸漬組織2小時(shí)，包埋成塊后4℃暫存。浸蠟需徹di以避免切片碎裂。

切片與烤片：
切片機(jī)切取4μm薄片，65℃烘烤1-2小時(shí)增強(qiáng)附著力。烤片后二甲苯脫蠟（15分鐘×2次），乙醇梯度水化至PBS。

關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1、固定時(shí)間：短于12小時(shí)可能導(dǎo)致固定不充分，超過(guò)24小時(shí)可能影響抗原表位。

2、脫水梯度：乙醇或蔗糖濃度需嚴(yán)格遞增，避免組織收縮變形。

3、OCT包埋：
包埋劑需覆蓋組織全周，避免氣泡；切片方向應(yīng)標(biāo)記清晰。

4、切片厚度：
冰凍切片宜8-10μm，石蠟切片4μm，過(guò)厚易脫片或染色不均。

通過(guò)規(guī)范化的前處理流程，能盡可能保留組織形態(tài)與生物分子活性，為后續(xù)HE染色、IHC或mIHC奠定基礎(chǔ)。實(shí)際操作中需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康撵`活調(diào)整參數(shù)，并嚴(yán)格參照試劑說(shuō)明書及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

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