多重?zé)晒馊旧?標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程

TSA信號放大原理：

利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合；然后微波清洗，前一輪非共價結(jié)合的抗體被洗掉，共價結(jié)合的熒光素還留存在樣品上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，最后去檢測結(jié)果。

mIHC試劑盒組分：TSA染料、信號放大液、多聚HRP二抗、抗熒光淬滅封片劑、DAPI

檢驗(yàn)方法：

1.所需儀器設(shè)備：移液器、恒溫干燥箱、微波爐、免疫組化筆（abs929）、修復(fù)杯、染色缸、計(jì)時器、孵育濕盒、蓋玻片、通風(fēng)櫥、洗瓶、熒光顯微鏡、量筒100ml、量筒1000ml等。

2.所需試劑：滅菌去離子水（abs9259）、二甲苯、乙醇（100%、95%、70%）、4%多聚甲醛（abs9179）、抗原修復(fù)液（abs9342/abs9248）、內(nèi)源性蛋白封閉液（abs933）、內(nèi)源過氧化物酶淬滅（abs9333）、TBST（abs952）、PBST（abs9340）等。

3.試劑準(zhǔn)備：

1）熒光染料的稀釋：染料為100×母液，使用信號放大反應(yīng)液按1:100稀釋制備染料工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配）；DAPI使用無菌水按1:100稀釋制備工作液。

2）二抗的使用：兔鼠通用的二抗，適用于兔和小鼠的一抗，樣本是除鼠兔之外的樣本，

兔的二抗，適用于兔的一抗，樣本是除兔以外的樣本。

4.檢測設(shè)備：熒光顯微鏡或熒光全片掃描設(shè)備，TSA單色熒光染料適用的激發(fā)和發(fā)射濾光片應(yīng)符合表中的建議。

【石蠟切片操作步驟】

1.脫蠟水合

a）新鮮二甲苯浸片10min，重復(fù)3次；

b）梯度乙醇浸片：100% 5min；95% 5min；70% 2min；

c）滅菌水洗片1min，重復(fù)3次；

d）10%中性福爾馬林或4%多聚甲醛（abs9179）浸片10-30min，滅菌水洗片1min，重復(fù)3次；（可選項(xiàng)，視樣本質(zhì)量而定）

e）滴加破膜劑（abs9149）通透15min，PBST（abs9340）浸洗3min，重復(fù)3次。（可選項(xiàng)，一般情況下可不做）

2.微波修復(fù)抗原

a）將脫蠟水合后的玻片置于修復(fù)杯中，用抗原修復(fù)液1×工作液浸沒；

b）將修復(fù)杯置于微波爐內(nèi)高火煮沸；

c）低火維持15min（注意補(bǔ)液，防止蒸發(fā)過度導(dǎo)致干片）；

d）取出室溫自然冷卻至室溫。

3.淬滅和封閉

a）去除玻片上殘存洗液；

b）用組化筆（abs929）圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加3%過氧化氫（abs9333）覆蓋樣本區(qū)域，孵育10min，PBST浸洗3min，重復(fù)3次；

c）去除玻片上殘存洗液，滴加封閉液（abs933），覆蓋樣本區(qū)域，室溫保濕震蕩10-30min，除去封閉液。

4.一抗孵育

a）去除玻片上的封閉液。

b）用移液器滴加稀釋的一抗溶液，浸沒樣本區(qū)域。

c）室溫保濕震蕩孵育1h（需針對不同抗體做優(yōu)化調(diào)整）。

d）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重復(fù)1次。

5.二抗孵育

a）去除玻片上殘存的洗液；

b）直接滴加HRP二抗工作液溶液，浸沒樣本區(qū)域；

c）室溫保濕孵育10min；

d）用1×TBST（abs952） buffer浸洗玻片3min，重復(fù)1次。

6.熒光染色放大信號

a）去除玻片上殘存的洗液。

b）用移液器在玻片上滴加1×染料工作液100ul（使用信號放大液按1:100稀釋）浸沒樣本區(qū)域。

c）室溫保濕震蕩孵育10min。

d）1×TBST buffer浸洗玻片，室溫浸片3min。重復(fù)3次。

e）微波修復(fù)，室溫自然冷卻至室溫或者用抗體洗脫液（abs994）洗掉未結(jié)合上的一二抗和染料。

f）滅菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2min。

7.新一輪染色（單染可直接進(jìn)行第8步）

a）每輪染色結(jié)束后可用熒光顯微鏡確認(rèn)染色情況，注意用TBST覆蓋樣品，防止干片。

b）封閉：去除玻片上殘存洗液，滴加封閉液，覆蓋樣本區(qū)域，室溫保濕震蕩10-30min，除去封閉液。（無需淬滅步驟）

c）重復(fù)步驟4-6

d）多輪染色重復(fù)步驟7，a）— c）結(jié)束后進(jìn)行染核及封片

8.染核及封片

滴加1×DAPI工作液到樣品上，浸沒樣本區(qū)域，室溫孵育5min。用1×TBST浸洗玻片3次，每次2min。然后滴加抗熒光淬滅封片劑（abs9853），用蓋玻片封片，避免氣泡，長期保存請用透明指甲油對蓋玻片邊緣進(jìn)行密封。

9.閱片

對染色后的組織片在熒光顯微鏡下觀察并分析。

【冰凍切片操作步驟】

需搭配抗體洗脫液（abs994）

1.淬滅、通透、封閉

a）從冰箱中取出冷凍玻片，恢復(fù)至室溫，PBST（abs9340）浸洗3min，重復(fù)3次；

b）10%中性福爾馬林或4%多聚甲醛（abs9179）浸片10-30min，滅菌水洗片1min，重復(fù)3次；（可選項(xiàng)，視樣本質(zhì)量而定）

c）滴加破膜劑（abs9149）通透15min，PBST浸洗3min，重復(fù)3次；（可選項(xiàng)，一般情況下可不做）

d）用組化筆（abs929）圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加3%過氧化氫（abs9333）覆蓋樣本區(qū)域，孵育10min，PBST浸洗3min，重復(fù)3次；

e）去除玻片上殘存洗液，滴加封閉液（abs933），覆蓋樣本區(qū)域，室溫保濕震蕩10-30min，除去封閉液。

2.一抗孵育

a）去除玻片上的封閉；

b）用移液器滴加稀釋的一抗溶液，浸沒樣本區(qū)域；

c）室溫保濕震蕩孵育1h（需針對不同抗體做優(yōu)化調(diào)整）；

d）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重復(fù)1次。

3.二抗孵育

a）去除玻片上殘存的洗液；

b）直接滴加HRP二抗工作液溶液，浸沒樣本區(qū)域；

c）室溫保濕孵育10min；

d）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重復(fù)1次。

4.熒光染色放大信號

a）去除玻片上殘存的洗液。

b）用移液器在玻片上滴加1×染料工作液100ul（使用信號放大液按1:100稀釋）浸沒樣本區(qū)域。

c）室溫保濕震蕩孵育10min。

d）1×TBST（abs952） buffer浸洗玻片，室溫浸片3min。重復(fù)3次。

e）滴加抗體洗脫液（abs994），37℃孵育15-20min。

f）滅菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2min。

5.新一輪染色（單染可直接進(jìn)行第6步）

a）每輪染色結(jié)束后可用熒光顯微鏡確認(rèn)染色情況，注意用TBST覆蓋樣品，防止干片；

b）封閉：去除玻片上殘存洗液，滴加封閉液，覆蓋樣本區(qū)域，室溫保濕震蕩10-30min，除去封閉液；

c）重復(fù)步驟2-4；

d）多輪染色重復(fù)步驟5，結(jié)束后進(jìn)行染核及封片。

6.染核及封片

滴加1×DAPI工作液到樣品上，浸沒樣本區(qū)域，室溫孵育5min。用1×TBST浸洗玻片3次，每次2min。然后滴加抗熒光淬滅封片劑（abs9853），用蓋玻片封片，避免氣泡，長期保存請用透明指甲油對蓋玻片邊緣進(jìn)行密封。

7.閱片

對染色后的組織片在熒光顯微鏡下觀察并分析。

【細(xì)胞樣本建議操作步驟】 

1.樣本準(zhǔn)備：制備細(xì)胞樣本（細(xì)胞爬片（abs7029）、細(xì)胞涂片等），建議直接使用腔室載玻片進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，方便后續(xù)檢測。完成制備后，用PBS簡單漂洗（2×2min）；

2.細(xì)胞固定：用4%多聚甲醛（abs9179）常溫固定10-20min，PBS洗滌3×5min；

3.淬滅內(nèi)源性過氧化物酶：滴加3% H2O2（abs9333），室溫下孵育10-30min，PBS洗滌3×5min；

4.細(xì)胞通透（胞膜指標(biāo)省略此步）：滴加含1-0.25% Triton X-100(abs9149)的PBS溶液，室溫下處理10min，PBS洗滌3×5min；

5.封閉：滴加封閉液（5%二抗同來源封閉血清（abs933）或BSA），室溫孵育30min；

6.一抗孵育：棄封閉液，滴加稀釋好的一抗工作液，于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜或37℃ 1-2h（濕盒中可加少量水，防止抗體孵育過程干片），PBS漂洗3×5min；

7.二抗孵育：滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP二抗覆蓋組織，避光室溫孵育20-50min，PBS漂洗3×5min；

8.染料孵育：滴加現(xiàn)配的1*TSA染料工作液（使用信號放大液按1:100稀釋），反應(yīng)1-10min，PBS漂洗3×5min；

9.抗體洗脫：抗體洗脫液（abs994）37℃預(yù)熱，甩去PBS后，滴加洗脫液浸潤整個爬片，洗脫時間可控制在15-30min（洗脫難度：結(jié)構(gòu)性膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白＞胞漿蛋白＞胞核蛋白），PBS漂洗3×5min；

10.重復(fù)進(jìn)行步驟[5→9]，直到完成所有指標(biāo)染色；

11.滴加1*DAPI工作液到樣品上，浸沒樣本區(qū)域，室溫孵育10min，PBS漂洗3×5min；

12.封片：滴加抗熒光淬滅封片劑（abs9853），用蓋玻片封片，避免氣泡。

13.掃描成像，數(shù)據(jù)分析。

【類器官樣本建議操作步驟】 

1、樣本準(zhǔn)備：

類器官收集 

收集生長至較大尺寸類器官：96孔板，生長密度較大時，使用移液槍取半孔以上，清洗1至3遍，洗去大部分基質(zhì)膠，離心沉淀，棄除大部分上清。2、瓊脂糖固定槽制備（可一次制備一批，溫密閉保存）

1）稱量0.2至0.4g瓊脂糖，加入至燒杯或者小試劑瓶內(nèi)；

2）加入10mL左右PBS；

3）微波爐高火融化，每隔5s暫停打開，觀察，重復(fù)數(shù)次至瓊脂糖融化wan全；

4）取約200uL融化瓊脂糖，加入至600uL EP管內(nèi)；

5）在盛有瓊脂糖的小EP管內(nèi)插入一小PCR管，使瓊脂糖形成一圓尖底凹槽，室溫或者4℃冰箱靜置數(shù)分鐘，至瓊脂糖凝固，輕輕轉(zhuǎn)動小PCR管，取出PCR管，可看到瓊脂糖內(nèi)形成一個深圓尖底槽。

類器官固定

1）將類器官輕輕吸出轉(zhuǎn)移至一固定槽底部；

2）輕輕加入PBS至高于瓊脂糖槽的邊緣；

3）蓋上蓋子，水平離心機(jī)1000rpm，離心5min；

4）輕輕吸出除底部類器官沉淀外的PBS上清；

5）加入融化的瓊脂糖液體200μL；

6）室溫靜置至瓊脂糖wan全凝固；

7）剪去固定管的底部和蓋子，置于2 mL EP管內(nèi)，加入多聚甲醛至差不多裝滿整個EP管，置于4℃冰箱過夜。

類器官包埋 

1）脫水：取出已凝固的含有類器官沉淀的瓊脂糖塊，在梯度乙醇中脫水，70%、80%、90%、95%乙醇各1h，100%乙醇30min, 待其凝固。

2）融蠟：提前4h左右打開烘箱，65℃溶蠟。

3）透明：將脫水完成后的瓊脂糖塊轉(zhuǎn)移至組織包埋盒中（二甲苯處理前需一直浸泡在無水乙醇中），將包埋盒轉(zhuǎn)移至二甲苯中5min處理兩次。

注：因二甲苯有毒性，需在通風(fēng)良好區(qū)域進(jìn)行操作，取出時盡量瀝盡殘留二甲苯。

4）浸蠟：透明化處理完成后立即轉(zhuǎn)入已經(jīng)融化的蠟缸中，60℃浸蠟2h后，更換新的蠟缸再次浸蠟2h。

5）包埋：包埋在冰盒上進(jìn)行，將融好的純蠟倒入蠟盒三分之一處，將瓊脂塊放置于中間位置，然后再滴蠟包埋直到倒?jié)M。待蠟塊wan全凝固后，小心脫下模具。

2、烤片：60℃烤片30min。

3、脫蠟、水化：二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——100%乙醇（5min）——100%乙醇（5min）— —95%乙醇（3min）——85%乙醇（3min）——75%乙醇（3min）——去離子水（5min)。

4、抗原修復(fù)：取200ml抗原修復(fù)液，加入染色盒中，將組織切片置于染色盒內(nèi)耐高溫塑料切片架上，置于高壓鍋內(nèi)加熱至飽壓，然后繼續(xù)加熱5min，關(guān)閉電源，10min后取出染色盒，室溫冷卻30min，畫上阻水圈，置入PBST浸洗3次，每次3min。

5、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：每切片加100μL3% H2O2（abs9333），室溫下孵育10min，PBST浸洗3min×3次。

6、封閉：除去PBST液，每張切片加100μL 5%山羊血清封閉液（abs933），室溫孵育30min，除去封閉液。

7、一抗孵育：每張切片加100μL一抗工作液，室溫保濕孵育1h，PBST浸洗3min×3次。

8、二抗孵育：除去PBST，每張切片加100μL二抗，室溫保濕孵育15min，PBST浸洗3次，每次3min。

9、染料孵育：除去PBST，每張切片加100μL現(xiàn)配的1*染料工作液（使用信號放大液按1:100稀釋），孵育10min后，置入 PBST內(nèi)洗滌，室溫浸片洗滌3次，每次3min。

10、抗體洗脫：抗體洗脫液（abs994）37℃ 預(yù)熱，滴加少量抗體洗脫液覆蓋樣本，室溫放置3~5min；棄去洗脫液，再次滴加足量的洗脫液覆蓋樣本，37°C 孵育20min；PBST浸洗3次，每次3min。

11、重復(fù)步驟（6）-（10），直至所有目標(biāo)抗體染色完成。

12、核染：滴加1*DAPI工作液到樣品上，浸沒樣本區(qū)域，室溫孵育10min后，用1*PBST浸洗玻片3次，每次2min。

13、封片：滴加抗熒光淬滅封片劑，用蓋玻片封片，避免氣泡。

14、掃描成像，數(shù)據(jù)分析。

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