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1. 背景介紹
在生物技術和免疫學領域，抗體親和配基是純化和檢測抗體的關鍵工具。這些配基是天然存在或經(jīng)過基因工程改造的蛋白質，能夠特異性地與抗體（免疫球蛋白）結合。其中，蛋白A、蛋白G、蛋白A/G和蛋白L是較常用和最重要的四種。它們各自具有特殊的結合特性，適用于不同來源、不同類型的抗體。
蛋白A (Protein A)
蛋白A是來源于金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 細胞壁的一種蛋白質。它是最早被發(fā)現(xiàn)和商業(yè)化應用的抗體親和配基之一。
蛋白G (Protein G)
蛋白G來源于G族和C族鏈球菌 (Streptococcus sp.)，為了提高其特異性，商業(yè)化的重組蛋白G通常會去除其白蛋白結合域，避免在從血清樣品中純化抗體時造成污染。
蛋白A/G (Protein A/G)
蛋白A/G是通過基因工程技術，將蛋白A和蛋白G的IgG結合域融合在一起而創(chuàng)造出的重組蛋白。它旨在結合二者的優(yōu)點，提供較廣泛的抗體結合能力。
蛋白L發(fā)現(xiàn)于消化鏈球菌 (Peptostreptococcus magnus) 的表面，其結合機制與前三者wan全不同，這使其具有特殊的應用價值。
圖1 抗體與抗體親和配基的作用區(qū)域
表1 蛋白A、G、L的抗體親和性差異分析
| 蛋白A | 蛋白G | 蛋白A/G | 蛋白L |
結合 | 主要與免疫球蛋白G（IgG）的Fc區(qū)域（重鏈的恒定區(qū)）結合。這種結合方式通常不會干擾抗體的抗原結合位點（Fab區(qū)） | 與蛋白A類似，主要結合IgG的Fc區(qū)域，但其結合位點和識別范圍與蛋白A有所不同 | 融合了蛋白A和蛋白G的多個IgG結合域 | 蛋白L不與抗體的Fc區(qū)結合，而是特異性地結合在抗體的κ輕鏈 (kappa light chain) 的可變區(qū) |
結合 | 對人IgG1、IgG2、IgG4 有很強的結合力
對兔、豬、狗、豚鼠等物種的IgG也有很好的親和力
缺點：對人IgG3和小鼠IgG1的結合力很弱，并且?guī)缀醪慌c人IgM、IgA、IgE以及禽類抗體（IgY）結合 | 相較于蛋白A，蛋白G的結合譜更廣。能強力結合所有的人IgG亞類 （IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）
對多種哺乳動物的IgG都有很強的親和力，包括小鼠、大鼠、山羊、牛、綿羊等。特別是它能有效結合蛋白A結合力弱的小鼠IgG1
缺點：仍然不與人IgM、IgA、IgE等其他類型的抗體結合 | 集蛋白A和蛋白G之長，具有較廣泛的IgG結合譜
能有效結合所有已知的人IgG亞類以及來自小鼠、大鼠、兔、山羊等幾乎所有常見研究物種的IgG | 由于其特殊的結合位點，蛋白L可以結合所有類別的免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA、IgE、IgD），前提是它們必須含有κ輕鏈。 能夠結合不含F(xiàn)c區(qū)的抗體片段，如Fab、F(ab')? 和單鏈抗體(scFv)。 缺點: 無法結合帶有λ輕鏈 (lambda light chain) 的抗體。在人類中，κ鏈與λ鏈的比例約為2:1，而在小鼠中幾乎所有抗體都帶κ鏈 |
主要 | 抗體純化：是工業(yè)上生產(chǎn)和實驗室純化單克隆抗體（特別是人源化抗體）較常用的配基。 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）：用于從復雜的樣品中捕獲目標抗原-抗體復合物。 | 通用型IgG純化：當需要純化來自多種不同物種的IgG，或者不確定抗體亞型時，蛋白G是比蛋白A更安全、更通用的選擇 小鼠單克隆抗體純化:對于小鼠來源的單抗，尤其是IgG1亞型，蛋白G是選擇 | 未知抗體的純化與檢測：當抗體的來源物種或亞型未知時，使用蛋白A/G可以較大程度地確保捕獲成功 篩選實驗：在需要捕獲多種不同抗體的實驗中非常有用，例如從血清中篩選自身抗體。 | 抗體片段純化：是純化Fab、scFv等重組抗體片段的理想工具 純化特定單抗：對于一些與蛋白A/G結合力弱但含有κ鏈的單抗，蛋白L是較好選擇 從血清培養(yǎng)基中純化抗體: 細胞培養(yǎng)基中通常含有來自牛血清的牛IgG，由于牛IgG主要是λ輕鏈，蛋白L不會與其結合，因此可以從復雜的培養(yǎng)上清中高純度地回收目標抗體（如人源或鼠源抗體） |
表2 抗體親和配基與不同來源及亞型抗體之間的親和?
種類 | 亞型 | 蛋白A | 蛋白G | 蛋白A/G | 蛋白L |
人 | IgG1 | +++ | +++ | +++ | +++ |
IgG2 | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgG3 | + | +++ | +++ | +++ | |
IgG4 | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgM | + | - | + | +++ | |
IgD | - | - | - | +++ | |
IgA | + | - | + | +++ | |
Fab | + | + | + | +++ | |
小鼠 | IgG1 | + | ++ | ++ | +++ |
IgG2a | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgG2b | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgG3 | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgM | - | - | - | +++ | |
大鼠 | IgG1 | + | ++ | ++ | +++ |
IgG2a | - | +++ | +++ | +++ | |
IgG2b | - | + | + | +++ | |
IgG2c | +++ | +++ | +++ | +++ | |
牛 | IgG1 | + | +++ | +++ | - |
IgG2 | +++ | +++ | +++ | - | |
山羊 | IgG1 | + | +++ | +++ | - |
IgG2 | +++ | +++ | +++ | - | |
馬 | IgG(ab) | + | - | + | NA |
IgG(c) | + | - | + | NA | |
IgG(T) | - | +++ | +++ | NA | |
兔 | IgG | +++ | +++ | +++ | + |
豬 | IgG | +++ | + | +++ | +++ |
狗 | IgG | +++ | + | +++ | NA |
雞 | IgY | - | - | - | - |
注：- 表示不包含；+ 表示中標組合；+++ 表示錯誤組合；NA 表示不適用或數(shù)據(jù)不可用。
2. 抗體親和純化填料參數(shù)：
類別 | 重組蛋白A 瓊脂糖凝膠FF | 重組蛋白G 瓊脂糖凝膠FF | 重耐堿蛋白A瓊脂糖凝膠FF | 蛋白A/G瓊脂糖凝膠FF | 重組蛋白L瓊脂糖凝膠FF |
基質 | 4%交聯(lián)瓊脂糖 | 4%交聯(lián)瓊脂糖 | 4%交聯(lián)瓊脂糖 | 4%交聯(lián)瓊脂糖 | 4%交聯(lián)瓊脂糖 |
配基 | 重組金黃色葡萄球菌蛋白 A，≥6 mg/mL | 重組鏈球菌蛋白 G，≥6 mg/mL，單點偶聯(lián) | 重組耐堿蛋白 A，≥6 mg/mL | 蛋白 A 蛋白 G 融合蛋白，≥6 mg/mL | 重組大消化鏈球菌蛋白 L，≥6 mg/mL |
粒徑范圍a | 45~165 μm | ||||
平均粒徑 | ~90 μm | ||||
動態(tài)結合載量b | ≥40 mg h-IgG/mL | ≥40 mg h-IgG/mL | ≥45 mg h-IgG/mL | ≥40 mg h-IgG/mL | ≥40 mg k 輕鏈h-IgG/mL |
推薦工作流速c | 60~300 cm/h | 60~300 cm/h | 60~300 cm/h | 60~150 cm/h | 60~300 cm/h |
最大流速與壓力d | ＞900 cm/h | ||||
使用 pH | 3~10（推薦的工作 pH），3~12（短期穩(wěn)定） | 3~9（推薦的工作 pH），2~10（短期穩(wěn)定） | 3~10（推薦的工作 pH），3~12（短期穩(wěn)定） | 3~10（推薦的工作 pH），3~12（短期穩(wěn)定） | 2~9（推薦的工作 pH），15 mM NaOH（CIP） |
化學穩(wěn)定性 | 在以下溶液中穩(wěn)定：常用的水相緩沖液、10~100 mmol/L NaOH、6 mol/L 鹽酸胍、70%乙醇。 | 在以下溶液中穩(wěn)定：常用的水相緩沖液、6 mol/L 鹽酸胍、70% 乙醇。 | 在以下溶液中穩(wěn)定：常用的水相緩沖液、0.1~0.5 mol/L 氫氧化鈉、6 mol/L 鹽酸胍、70%乙醇等。 | 在以下溶液中穩(wěn)定：常用的水相緩沖液、0.1~0.5 mol/L 氫氧化鈉、6 mol/L 鹽酸胍、70%乙醇等。 | 在以下溶液中穩(wěn)定：常用的水相緩沖液、6 mol/L 鹽酸胍、70% 乙醇。 |
注：a：90%體積以上的微球在此粒徑范圍；
b：DBC10%測試條件為：10%流穿，6 min 停留時間；
c：推薦流速是指該流速可滿足大部分柱高下 2~6 min 停留時間的使用條件，并非只能在該流速范圍內工作；
d：10 cm 柱高下的最大測試流速。
3. 應用數(shù)據(jù)：
圖2 工藝溶劑穩(wěn)定性
圖3 不同蛋?A填料對NaOH的耐受性
圖4 不同蛋?G填料的洗脫曲線，樣品為h-IgG
圖5
填料：重耐堿蛋白A瓊脂糖凝膠FF（中壓預裝柱）（Cat: abs91003-M）；
樣品：牛血清，相對于填料約20 mg IgG/mL填料；
上樣、結合緩沖液： 20 mM PB, 150 mM NaCl, pH 7.4, 10 CV；
洗脫緩沖液：100mM甘氨酸，pH 3.0，14 CV；
在位清洗（CIP）：100mM NaOH，10 CV
4. 愛必信抗體親和純化填料產(chǎn)品信息
貨號 | 產(chǎn)品名稱 |
abs91001-F | 重組蛋白A 瓊脂糖凝膠FF |
abs91001-G | 重組蛋白A 瓊脂糖凝膠FF（重力預裝柱） |
abs91001-M | 重組蛋白A 瓊脂糖凝膠FF（中壓預裝柱） |
abs91002-F | 重組蛋白G 瓊脂糖凝膠FF |
abs91002-G | 重組蛋白G 瓊脂糖凝膠FF（重力預裝柱） |
abs91002-M | 重組蛋白G 瓊脂糖凝膠FF（中壓預裝柱） |
abs91003-F | 重耐堿蛋白A瓊脂糖凝膠FF |
abs91003-M | 重耐堿蛋白A瓊脂糖凝膠FF（中壓預裝柱） |
abs91003-G | 重耐堿蛋白A瓊脂糖凝膠FF（重力預裝柱） |
abs91004-F | 蛋白A/G瓊脂糖凝膠FF |
abs91004-M | 蛋白A/G瓊脂糖凝膠FF（中壓預裝柱） |
abs91004-G | 蛋白A/G瓊脂糖凝膠FF（重力預裝柱） |
abs91005-F | 易洗脫蛋白G瓊脂糖凝膠FF |
abs91005-M | 易洗脫蛋白G瓊脂糖凝膠FF（中壓預裝柱） |
abs91005-G | 易洗脫蛋白G瓊脂糖凝膠FF（重力預裝柱） |
abs91006-F | 重組蛋白L瓊脂糖凝膠FF |
abs91006-M | 重組蛋白L瓊脂糖凝膠FF（中壓預裝柱） |
abs91006-G | 重組蛋白L瓊脂糖凝膠FF（重力預裝柱） |
參考文獻：
[1] Arora S, Saxena V, Ayyar BV. Affinity chromatography: A versatile technique for antibody purification. Methods. 2017 Mar 1;116:84-94. doi: 10.1016/j.ymeth.2016.12.010. Epub 2016 Dec 22. PMID: 28012937.
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