百日咳毒素：從基礎(chǔ)特性到前沿實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的全面指南

一、百日咳毒素的基本概念與生化特性

百日咳毒素（Pertussis Toxin，PTX）是百日咳鮑特菌（Bordetella pertussis）分泌的一種關(guān)鍵毒力因子，也是引起人類百日咳的主要致病物質(zhì)。這種毒素在細(xì)菌感染過程中扮演著多重角色，既能促進(jìn)細(xì)菌附著于宿主呼吸道纖毛細(xì)胞，又能夠干擾宿主細(xì)胞的正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而幫助細(xì)菌逃避免疫系統(tǒng)的清除。從結(jié)構(gòu)上看，百日咳毒素是一種AB5型多亞基外毒素，由一個(gè)具有酶活性的A原聚體（S1亞基）和五個(gè)負(fù)責(zé)結(jié)合細(xì)胞受體的B寡聚體（S2、S3、S4、S5亞基）組成。這種特殊的結(jié)構(gòu)使得毒素能夠像精密鑰匙一樣鎖定并進(jìn)入特定類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

百日咳毒素的分子量范圍在9-28kDa之間，各亞基通過非共價(jià)鍵連接形成穩(wěn)定的金字塔形結(jié)構(gòu)。其中，S1亞基（也稱為A啟動(dòng)子）是毒素的活性中心，具有NAD+糖基水解酶和ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性。單獨(dú)的A啟動(dòng)子能夠?qū)AD+的ADP核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到Gαi、Gαo或Gαt家族G蛋白的α亞基上。而B寡聚體則負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞表面的特異性受體（包括TLR4和糖蛋白Ib等蛋白的多糖殘基），通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用引導(dǎo)整個(gè)毒素分子進(jìn)入細(xì)胞。

進(jìn)入細(xì)胞后，百日咳毒素經(jīng)歷一個(gè)復(fù)雜的活化過程。它通過胞內(nèi)體途徑和高爾基體復(fù)合物進(jìn)行逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，最終進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在那里，A啟動(dòng)子從PTX上解離并穿透內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)開始其酶促活動(dòng)。這一精巧的分子機(jī)制使得百日咳毒素能夠準(zhǔn)確地靶向細(xì)胞內(nèi)部的關(guān)鍵信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，特別是異三聚體G蛋白通路。

百日咳毒素的生化作用機(jī)制主要體現(xiàn)在它能夠催化G蛋白α亞基的ADP-核糖基化。具體來(lái)說(shuō)，它的目標(biāo)主要是Gi、Go和Gt等異三聚體鳥嘌呤核苷酸調(diào)節(jié)蛋白的α亞基。這一修飾阻止了G蛋白異源三聚體與受體的正常相互作用，使它們無(wú)法完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。由于Gα亞基持續(xù)處于與GDP結(jié)合的非活性狀態(tài)，導(dǎo)致下游的腺苷酸環(huán)化酶無(wú)法失活，K+通道無(wú)法正常開啟。這種對(duì)于細(xì)胞信號(hào)通路的干擾是百日咳毒素多種生理效應(yīng)的分子基礎(chǔ)，同時(shí)也成為了科學(xué)家研究G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要工具。

Absin百日咳毒素（#abs42024900）

二、百日咳毒素的多樣化應(yīng)用領(lǐng)域

百日咳毒素作為一種重要的生物工具，在多個(gè)研究領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其應(yīng)用價(jià)值主要源于其對(duì)G蛋白信號(hào)通路的特異性干擾能力。

1、G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的核心工具

在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中，百日咳毒素被譽(yù)為G蛋白功能的特異性抑制劑。由于它能夠通過ADP-核糖基化不可逆地抑制Gi/o家族G蛋白的功能，研究人員可以精確地分析特定信號(hào)通路中G蛋白的參與程度。例如，當(dāng)研究一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的激活機(jī)制時(shí)，加入百日咳毒素預(yù)處理可以幫助確定該受體是否通過Gi/o蛋白介導(dǎo)其效應(yīng)。在HEK293T細(xì)胞研究中，科學(xué)家使用50ng/ml的PTX預(yù)處理，有效阻斷了QRFP26受體介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，明確了該受體信號(hào)通路對(duì)PTX敏感的G蛋白的依賴性。類似的方法也廣泛應(yīng)用于研究腺苷酸環(huán)化酶-cAMP系統(tǒng)、離子通道調(diào)節(jié)以及各種細(xì)胞因子產(chǎn)生的分子機(jī)制。

值得注意的是，不同細(xì)胞類型對(duì)百日咳毒素的敏感性存在差異，因此在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中需要優(yōu)化毒素的使用濃度和作用時(shí)間。根據(jù)研究報(bào)道，在CHO細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)（CHO細(xì)胞簇集生長(zhǎng)模式）所需PTX的最di濃度可低至0.03ng/ml。此外，百日咳毒素在腺苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出高效的催化活性，依照Wolff等人的方法測(cè)量，其腺苷酸環(huán)化酶活性可達(dá)9 picomoles/min/μg。這些特性使百日咳毒素成為研究細(xì)胞信號(hào)機(jī)制的不可huo缺的工具。

2、自身免疫疾病模型構(gòu)建的關(guān)鍵試劑

在神經(jīng)免疫學(xué)研究領(lǐng)域，百日咳毒素是構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE）模型的關(guān)鍵輔助劑，該模型是研究多發(fā)性硬化癥（Multiple Sclerosis，MS）最chang用的動(dòng)物模型。PTX通過與髓鞘特異性抗原（如MOG（35-55）、PLP（139-151）、PLP（178-191）等免疫肽）聯(lián)合注射，顯著提高疾病模型的誘導(dǎo)成功率。

百日咳毒素在EAE模型中的作用機(jī)制是多方面的：它通過改變血腦屏障的通透性，促進(jìn)炎癥細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)；同時(shí)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，偏向于促炎性Th1和Th17細(xì)胞的分化，抑制抗炎性Th2細(xì)胞反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，PTX驅(qū)動(dòng)髓樣細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，這是初始T細(xì)胞分化為致病性Th1/Th17細(xì)胞的先決條件。這種免疫調(diào)節(jié)功能對(duì)于打破自身抗原的免疫耐受，建立穩(wěn)定的自身免疫反應(yīng)至關(guān)重要。

除了EAE模型，近期研究還探索了百日咳毒素在其他疾病模型中的應(yīng)用。例如，一項(xiàng)2023年發(fā)表在《青?？萍肌返难芯勘砻鳎偃湛榷舅芈?lián)合卡介苗可以成功誘導(dǎo)CD-1小鼠產(chǎn)生持續(xù)性抑郁樣行為，從而建立一種新型抑郁癥動(dòng)物模型。該研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)使用低劑量卡介苗相比，PTX聯(lián)合處理顯著增強(qiáng)了小鼠的行為絕望狀態(tài)，降低了探索性行為和自發(fā)運(yùn)動(dòng)，同時(shí)促進(jìn)了中樞神經(jīng)炎癥和外周炎癥因子（如IL-1β、IL-6、IFN-γ等）的釋放。這種模型表現(xiàn)出至少持續(xù)28天的抑郁表型，為抗抑郁治療研究提供了寶貴的時(shí)間窗口。

3、疫苗研發(fā)與質(zhì)量控制中的應(yīng)用

作為百日咳的主要毒力因子，百日咳毒素自然是無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗（Acellular Pertussis Vaccine，APV）的核心成分之一。在所有目前可用的百日咳疫苗中，PTX都是主要免疫原，且抗PTX抗體的存在與保護(hù)兒童免受百日咳疾病密切相關(guān)。因此，疫苗研發(fā)和生產(chǎn)過程中對(duì)百日咳毒素的檢測(cè)和質(zhì)量控制顯得尤為重要。

在疫苗生產(chǎn)過程中，需要確保毒素經(jīng)過適當(dāng)處理，降低其毒性而保留免疫原性。目前存在兩種主要的脫毒方法：化學(xué)脫毒和遺傳脫毒?；瘜W(xué)脫毒使用甲醛或戊二醛等化學(xué)試劑處理毒素，而遺傳脫毒則是通過對(duì)PTX結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變來(lái)實(shí)現(xiàn)。研究表明，遺傳脫毒的PTX在安全性和免疫原性方面優(yōu)于化學(xué)脫毒的PTX，這可能代表未來(lái)疫苗發(fā)展的方向。

在疫苗質(zhì)量控制中，CHO細(xì)胞簇集試驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)百日咳毒素的殘余du性。該方法的原理是PTX會(huì)引起中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞出現(xiàn)特殊的簇集生長(zhǎng)模式，通過觀察這種形態(tài)變化可以靈敏地檢測(cè)PTX的生物學(xué)活性。研究比較了不同來(lái)源的CHO細(xì)胞對(duì)PTX的敏感性，發(fā)現(xiàn)來(lái)自ATCC的CHO細(xì)胞對(duì)PTX最wei敏感。此外，小鼠體內(nèi)檢測(cè)法（包括小鼠組胺致敏試驗(yàn)和小鼠白細(xì)胞增多試驗(yàn)）也常用于評(píng)估PTX的毒性，研究表明CHO細(xì)胞簇集法與這些體內(nèi)檢測(cè)方法之間存在一定的相關(guān)性。

三、百日咳毒素的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)方案

1、在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的應(yīng)用方法

在G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中，百日咳毒素作為Gi蛋白家族的特異性抑制劑，幫助研究人員闡明特定信號(hào)通路的分子機(jī)制。以下是典型的PTX應(yīng)用方案：

• 首先，需要制備百日咳毒素工作液。常見的PTX商品通常以凍干粉形式提供，含有氯化鈉和磷酸鈉緩沖鹽。使用前應(yīng)用無(wú)菌緩沖液重構(gòu)，并分裝保存于-20°C。避免反復(fù)凍融，以防止蛋白變性失活。

• 在進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常需要在無(wú)血清培養(yǎng)基中加入100-200ng/ml的PTX，預(yù)處理細(xì)胞4-24小時(shí)（取決于細(xì)胞類型）。例如，在研究GPCR信號(hào)通路時(shí)，科學(xué)家通常使用50-100ng/ml的PTX預(yù)處理HEK293T細(xì)胞16小時(shí)，以有效抑制Gi蛋白信號(hào)。值得注意的是，不同細(xì)胞系對(duì)PTX的敏感性存在差異，建議通過濃度梯度實(shí)驗(yàn)確定最jia處理?xiàng)l件。

• PTX處理效果的驗(yàn)證有多種方法。最直接的是檢測(cè)cAMP水平的積累，因?yàn)镚i蛋白的主要功能是抑制腺苷酸環(huán)化酶，PTX處理應(yīng)解除這種抑制，導(dǎo)致基礎(chǔ)cAMP水平升高。此外，還可以通過Western blot檢測(cè)G蛋白α亞基的ADP-核糖基化，或使用PTX催化的ADP-核糖基化實(shí)驗(yàn)直接測(cè)定其活性。

2、自身免疫疾病模型建模方案

在構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型時(shí)，百日咳毒素的使用至關(guān)重要。以下是典型的誘導(dǎo)方案：

1. 首先，在誘導(dǎo)當(dāng)天，給小鼠（通常為C57BL/6或SJL品系）皮下注射含有所需自身抗原（如MOG35-55肽）的完quan弗氏佐劑乳化液。

2. 隨后，在免疫當(dāng)天（第0天）和48小時(shí)后（第2天），通過尾靜脈或腹腔注射200-400ng PTX（溶于100-200μl PBS）。有些實(shí)驗(yàn)方案可能會(huì)在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)追加PTX注射，以增強(qiáng)疾病發(fā)生率和發(fā)展程度。

在抑郁癥動(dòng)物模型研究中，PTX的應(yīng)用方法有所不同。一項(xiàng)2023年的研究采用了百日咳毒素聯(lián)合卡介苗的方案：首先給CD-1小鼠注射0.2mg/kg的PTX，一周后注射低劑量的卡介苗（1×10^6 CFU）。這種聯(lián)合處理成功誘導(dǎo)出了持續(xù)性的抑郁樣行為，包括懸尾試驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間增加、開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)距離和探索行為減少等。

使用PTX建立自身免疫疾病模型時(shí)需注意：

• PTX的劑量、注射時(shí)間點(diǎn)和注射途徑都會(huì)影響模型的表現(xiàn)；

• 動(dòng)物品系、年齡和飼養(yǎng)環(huán)境也會(huì)影響對(duì)PTX的敏感性；

• 應(yīng)設(shè)立合適的對(duì)照組，包括僅接受抗原免疫、僅接受PTX處理以及完quan未處理的對(duì)照組，以正確解讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3、疫苗質(zhì)量檢測(cè)與脫毒工藝監(jiān)控

在無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)過程中，監(jiān)控百日咳毒素的脫毒效果和殘余du性是至關(guān)重要的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)。以下是常用的檢測(cè)方法：

• CHO細(xì)胞簇集試驗(yàn)：是檢測(cè)PTX生物活性的靈敏方法。具體步驟包括：將來(lái)自ATCC的CHO細(xì)胞接種于96孔板，加入系列稀釋的待測(cè)樣品，37°C培養(yǎng)48-72小時(shí)后，顯微鏡下觀察細(xì)胞簇集現(xiàn)象。產(chǎn)生陽(yáng)性簇集反應(yīng)的最diPTX濃度可低至0.03ng/ml。這種方法適用于疫苗純化過程中的中間品控制和最終成品檢驗(yàn)。

• 小鼠體內(nèi)法：包括小鼠組胺致敏試驗(yàn)和小鼠白細(xì)胞增多試驗(yàn)。前者通過檢測(cè)小鼠對(duì)組胺挑戰(zhàn)的敏感性來(lái)評(píng)估PTX活性，后者則通過計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞數(shù)量變化來(lái)反映PTX的生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，這兩種體內(nèi)檢測(cè)方法結(jié)果之間存在顯著的正相關(guān)（r=0.881），而CHO細(xì)胞簇集法則與體內(nèi)法呈負(fù)相關(guān)。

現(xiàn)代疫苗研發(fā)趨勢(shì)正在從化學(xué)脫毒轉(zhuǎn)向遺傳脫毒的PTX。遺傳脫毒是通過對(duì)PTX結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，降低其毒性而保留免疫原性。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是避免了化學(xué)處理可能導(dǎo)致的表位破壞，從而提供更保護(hù)性的免疫反應(yīng)。然而，即使轉(zhuǎn)向遺傳脫毒的PTX，目前的百日咳疫苗仍不能完quan防止百日咳鮑特菌感染，開發(fā)具有長(zhǎng)期免疫力并能防止感染的新型疫苗仍是未來(lái)研究的重點(diǎn)。

四、總結(jié)與展望

百日咳毒素作為百日咳鮑特菌產(chǎn)生的主要毒力因子，已從單純的致病因子轉(zhuǎn)變?yōu)樯镝t(yī)學(xué)研究的多功能工具。憑借其特異性修飾G蛋白α亞基的能力，PTX已成為研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、構(gòu)建疾病模型和疫苗研發(fā)中不可huo缺的試劑。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是基因工程技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)百日咳毒素的研究和應(yīng)用也在不斷深入。

未來(lái)百日咳毒素的研究方向可能包括開發(fā)特異性更高的變異體，能夠針對(duì)特定G蛋白亞型而不影響其他相關(guān)蛋白；探索PTX在新型疾病模型中的應(yīng)用，如神經(jīng)退行性疾病或代謝性疾病模型；以及優(yōu)化遺傳脫毒PTX疫苗，提供更安全、更有效的百日咳免疫保護(hù)。

注意事項(xiàng)：

盡管百日咳毒素在科學(xué)研究中價(jià)值巨大，但使用時(shí)必須注意生物安全。PTX屬于警告級(jí)危險(xiǎn)品，可能引起眼睛和皮膚刺激，甚至器官毒性。操作時(shí)應(yīng)佩戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)裝備，包括護(hù)目鏡、手套和防護(hù)服，并在專門的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，確保安全操作的同時(shí)，也保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。通過深入了解百日咳毒素的特性和應(yīng)用方法，研究人員可以更好地利用這一強(qiáng)大工具，推動(dòng)生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)步。

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