Human IL-13 ELISA Kit

本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被有人白細(xì)胞介素13(IL-13)捕獲抗體的微孔中，依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、生wu素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，HRP酶結(jié)合物，中間經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，用底物TMB顯色，TMB 在過(guò)氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。 顏色的深淺和樣本中的人白細(xì)胞介素13(IL-13)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣本濃度。

Human

3.12-200pg/mL

1.17pg/mL

一、實(shí)驗(yàn)所需自備試驗(yàn)器材：
1、酶標(biāo)儀（450nm）
2、高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、5-50uL、20-200uL、200-1000uL
3、37℃恒溫箱
4、蒸餾水或去離子水

二、樣本處理及要求：
試劑盒檢測(cè)范圍不等同于樣本中待測(cè)物的濃度范圍，建議實(shí)驗(yàn)前通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)估樣本中待測(cè)物的濃度并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣本的實(shí)際濃度。如果樣本中待測(cè)物濃度過(guò)高或過(guò)低，請(qǐng)對(duì)樣本做適當(dāng)?shù)南♂尰驖饪s。
若所檢樣本不在說(shuō)明書所列樣本類型之中，建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其檢測(cè)有效性。
血清：將收集于血清分離管的全血樣本在室溫放置2小時(shí)或2-8℃過(guò)夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集樣本，并將樣本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
組織勻漿：用預(yù)冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果），稱重后將組織jian碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣本對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨或勻漿機(jī)研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。
細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
細(xì)胞裂解液：貼壁細(xì)胞用預(yù)冷PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白mei消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮細(xì)胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用預(yù)冷PBS清洗3次，每1×10^6個(gè)細(xì)胞中加入150-200μLPBS重懸（推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可適當(dāng)減少PBS體積）并通過(guò)反復(fù)凍融或超聲使細(xì)胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測(cè)。
其它生物樣本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)。
樣本外觀：樣本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。
樣本保存：樣本收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融，樣本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血樣本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

三、樣本稀釋方案：
請(qǐng)?zhí)崆邦A(yù)估樣本的濃度范圍，如果您的檢測(cè)樣本需要稀釋，參考稀釋方案如下：
稀釋100倍：一步稀釋。取5μL樣本到495μL通用稀釋液內(nèi)，做100倍稀釋；
稀釋1000倍：兩步稀釋。取5μL樣本到95μL通用稀釋液內(nèi)，做20倍稀釋，再取5μL20倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內(nèi)，做50倍稀釋，總共稀釋1000 倍；
稀釋100000 倍：三步稀釋。取5μL樣本到195μL通用稀釋液內(nèi)，做40倍稀釋，再取5μL40倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內(nèi)，做50倍稀釋，最后取5μL 2000 倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內(nèi)，做50倍稀釋，總共稀釋100000倍；
每步稀釋時(shí)取液量不少于3μL，稀釋倍數(shù)不超過(guò)100倍。每步稀釋都需混合均勻，避免起泡。

四、檢測(cè)前準(zhǔn)備工作：
1、請(qǐng)?zhí)醧ian 10分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。
2、標(biāo)準(zhǔn)品梯度工作液配制：加入 1mL 通用稀釋液至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其wan全溶解后輕輕混勻(濃度為200pg/mL)，然后按照以下濃度：200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL、3.12pg/mL、0pg/mL進(jìn)行稀釋。
倍比稀釋方法：取7支EP管，每管中加入500μL通用稀釋液,200pg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成100pg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔，不需要再?gòu)牡箶?shù)第二管中吸取液體，具體如下圖。
3、生wu素化檢抗工作液配制：使用前15分鐘將100×濃縮生wu素化檢抗于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮生wu素化檢抗稀釋成1×工作濃度(例：10μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，現(xiàn)配現(xiàn)用。
4、酶結(jié)合物工作液配制：使用前15分鐘將100×濃縮酶結(jié)合物于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮酶結(jié)合物稀釋成1×工作濃度(例：10 μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，現(xiàn)配現(xiàn)用。
5、1×洗滌液配制：取10mL20×洗滌液到190mL蒸餾水中（從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，可放置室溫，待結(jié)晶wan全溶解后再配制)。

五、操作步驟：
1、從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2、加樣：分別將樣本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照100μL每孔加入相應(yīng)孔中，空白孔加入100μL通用稀釋液。蓋上封板膜后37℃溫育60分鐘。（建議：將待測(cè)樣本用通用稀釋液zui低稀釋1倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測(cè)試。從而減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，最后計(jì)算樣本濃度時(shí)需乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)中建議設(shè)立復(fù)孔）。
3、加生wu素化檢抗：取出酶標(biāo)板，棄去液體，不用洗滌。每孔直接加入100μL生wu素化檢抗工作液，蓋上封板膜后37℃溫育60分鐘。
4、洗板：棄去液體，每孔加入300μL1x洗滌液，靜置1分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板3次（也可用洗板機(jī)洗板）。
5、加酶結(jié)合物工作液：每孔加入100μL酶結(jié)合物工作液，蓋上封板膜后37℃溫育30分鐘。
6、洗板：棄去液體按步驟4洗滌方法，洗板5次。
7、加底物：每孔加入90μL底物(TMB)，蓋上封板膜，37℃避光溫育15分鐘。
8、加終止液：取出酶標(biāo)板，每孔直接加入50μL終止液，立即在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算：
結(jié)果判斷：
1、計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均 OD值并減去空白孔的 OD 值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo) ，在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
七、試劑盒性能：
1、重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。
2、回收率：在選取的健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入3個(gè)不同濃度水平的人IL-13，計(jì)算回收率。
3、線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人IL-13，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評(píng)估線性。

白細(xì)胞介素-13（IL-13）是由位于5號(hào)染色體上的IL13基因表達(dá)的。IL-13是一個(gè)132個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，含有一個(gè)擬議的20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，與人類IL-4有大約30%的氨基酸序列同源性。此外，這兩種細(xì)胞因子表現(xiàn)出重疊的生物活性。人的IL-13是由激活的Th0、Th1類Th2類和CD8T細(xì)胞產(chǎn)生。與 IL-4相似，IL-13對(duì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的分化和功能有多種影響。IL-13可以 抑制單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能。

Human

未開封試劑盒，4°C儲(chǔ)存，有效期6個(gè)月。

1、嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫 20-25℃。使用后立即冷藏試劑。
2、洗板不正確可能導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。整個(gè)過(guò)程中不要讓微孔干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
3、清潔板底殘留的液體和手指印，否則影響 OD 值。
4、底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
5、避免試劑和樣本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。
6、在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
7、任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中試劑的生物活性。
8、不能使用過(guò)期產(chǎn)品，不同貨號(hào)和批號(hào)組分不得混用。
9、試劑盒以外來(lái)源的重組蛋白可能會(huì)出現(xiàn)與本試劑盒抗體不匹配而不被識(shí)別的情況。
10、如果可能傳播疾病，所有的樣本都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣本和檢測(cè)裝置。