Mouse IL-12 p70 ELISA Kit

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Mouse IL-12 p70 ELISA Kit采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術。特異性抗小鼠IL-12 p70抗體預包被在高親和力的酶標板上。酶標板孔中加入標準品、待測樣本和生wu素化的檢測抗體，經(jīng)過孵育，樣本中存在的IL-12 p70與固相抗體和檢測抗體結合，形成免疫復合物。洗滌去除未結合的物質后，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應，在450nm波長（參考校正波長540nm或570nm）測定吸光度值。

Mouse

39.06pg/mL-2500pg/mL

需自備試驗器材
1. 酶標儀（可測量450nm檢測波長的吸收值及540nm或570nm校正波長的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動洗板機
5. 500mL量筒

一、實驗前準備
1. 樣品收集及儲存
①細胞培養(yǎng)上清：顆粒物應通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉速為1000g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血劑收集血漿，在收集后30分鐘內離心15分鐘，轉速為1000g，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實驗樣本和標準品做復孔檢測）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實際操作時可先計算使用量，再進行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實際操作時可先依據(jù)樣本稀釋倍數(shù)，計算所需的稀釋用緩沖液用量，再進行配制。
③檢測抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計算所需體積。例：使用了10個孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
⑤顯色劑：按每孔100uL，計算當次試驗所需要用量，取出相應體積的顯色劑，避光；取出的顯色劑僅供當日使用。
⑥標準品：凍干標準品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為2500pg/mL標準品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標準品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標準品母液可用作標準曲線最高點（2500pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標準曲線零點（0pg/mL）。
二、操作步驟
1. 準備好所有需要的試劑和標準品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標準品，實驗樣本或者質控品加入相應孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時;
5. 將板內液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內洗滌液吸去。重復操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結果。最后一次洗板結束，請將板內所有液體吸干或將板倒置，在吸水紙拍干所有殘留液體；
6. 在每個微孔內加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時；
7. 重復第5步洗板操作；
8. 在每個微孔內加入100uLSA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復第5步洗板操作；
10. 在每個微孔內加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個微孔內加入50uL終止液，孔內溶液顏色會從藍色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內，使用酶標儀測量450nm的吸光度值，設定540nm或570nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結果準確度可能會受影響；
13. 計算結果：將每個標準品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標準品OD值。使用計算機軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標準曲線。另一種方法是，可以通過繪制標準品濃度做對數(shù)與相應OD值對數(shù)生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過稀釋，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。
注：提供的標準曲線數(shù)據(jù)僅供參考，應根據(jù)同次試驗所繪標準曲線計算樣本含量。

三、試劑盒參數(shù)
1. 回收率：在細胞培養(yǎng)基樣本中摻入不同水平的小鼠IL-12 p70，測定其回收率。回收率范圍在83-107%，平均回收率在93%。
2. 靈敏度：小鼠IL-12 p70的zui低可測劑量（MDD）一般小于2.24pg/mL。zui低可測值是根據(jù)20個標準曲線零點吸光值的平均值加兩倍標準差計算得到的相對應濃度。
3. 校正：此ELISA試劑盒經(jīng)大腸桿菌表達的高純度重組小鼠IL-12 p70蛋白所校正。
4. 線性：4個不同的樣本中摻入高濃度的小鼠IL-12 p70，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測范圍內，測定其線性。

5. 特異性：此ELISA法可檢測天然及重組小鼠IL-12 p70蛋白。將以下因子用稀釋劑（1×）配制成 50ng/mL的濃度來檢測與小鼠IL-12 p70的交叉反應。將50ng/mL的干擾因子摻入中間范圍的重組小鼠IL-12 p70對照品中，來檢測對小鼠IL-12 p70的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應或干擾。含濃度1.25ng/mL 的重組大鼠 IL-12 p70 有交叉反應性。


四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無顏色出現(xiàn)）

2. 花板（空白、陰性陽性對照正常，但標本孔OD值明顯偏高）

五、實驗流程圖

白細胞介素12（IL-12，也稱NKSF），是70-75kDa的異源二聚體糖蛋白，屬于IL-12異源二聚體細胞因子家族。IL-12由35kDa（p35）和40kDa（p40）的兩個亞基構成，這兩個亞基由二硫鍵相連，相互間無氨基酸序列同源性。成熟的p35亞基有196個氨基酸，包含七個半胱氨suan及一個潛在的N-連接糖基化位點。成熟的小鼠p35與人和大鼠的氨基酸同源性分別為63%和86%。成熟的小鼠p40亞基長313個氨基酸，包括13個半胱氨suan和5個潛在的N-連接糖基化位點。有研究報道p40序列具有多態(tài)性，但這個IL-12 p70試劑盒不識別這些等位基因產(chǎn)物。
成熟的小鼠p40和人及大鼠的氨基酸同源性分別為72%和93%。雖然p35類似于促紅細胞生成素的配體，但p40更類似促紅細胞生成素受體的N-端，有WSXWS結構域、一個免疫球蛋白樣結構域和四個保守的半胱氨suan。這表明IL-12可能是細胞因子受體模擬物，類似于IL-6/可溶性IL-6R復合物。值得注意的是p40可以以單體或同源二聚體形式存在，而p35卻從來沒有發(fā)現(xiàn)單體形式。p40是白介素23（IL-23）兩個亞基中較大的亞基。雖然IL-12一直被認為是一種分泌型分子，人們在人和小鼠細胞中也發(fā)現(xiàn)了膜結合型IL-12。產(chǎn)生IL-12的細胞包括巨噬細胞、樹突狀細胞、單核細胞、朗格漢斯細胞、中性粒細胞、角質形成細胞、類漿樹突狀細胞、小膠質細胞、CD8+DC（僅小鼠細胞）和非生發(fā)中心的（CD38-CD44+）B細胞（僅人體細胞）。
小鼠IL-12的高親和力受體是由至少2個I型跨膜糖蛋白組成，類似于細胞因子受體超家族成員。第一個亞基（Rβ1）為100kDa，以Kd=1nM與IL-12結合。這個受體是p40亞基的主要結合位點；第二個亞基（Rβ2）為130kDa，與Rβ1亞基無氨基酸同源性。這個受體是信號轉導的重要組成部分，作為一個二硫鍵相連的p30-p40二聚體的附著點。如上所述，小鼠p40以單體、二聚體形式存在，或于p35結合形成IL-12，或于p19結合形成IL-23。同源二聚體p40和IL-23都可以結合IL-12R，作為不傳遞信號的拮抗劑。或者p40同源二聚體也可以與Rβ1結合，激活小膠質細胞和巨噬細胞。從功能上而言，IL-12已被證明能夠增強細胞毒性、誘導NK細胞、T細胞和樹突狀表皮T細胞產(chǎn)生γ干擾素。有報道表明，IL-12能誘導巨噬細胞產(chǎn)生γ干擾素。與IL-23和IL-27等其IL-12的家族成員一起，IL-12能促進CD4+Th1型免疫反應的進展。作為感染應答，IL-27最先分泌，促進TH0向THR0/1過度，隨后分泌IL-12，產(chǎn)生Th1效應細胞。與IL-18、IL-12一起產(chǎn)生把效應細胞轉化Th1記憶細胞，接著這些細胞被IL-23激活。

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1. 請在試劑盒有效期內使用。
2. 不同試劑盒及不同批號試劑盒的組分不能混用。
3. 樣本值若大于標準曲線的最高值，應將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測；若細胞培養(yǎng)上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑稀釋外，其它中間稀釋可采用細胞培養(yǎng)基。
4. 檢測結果的不同可由多種因素引起，包括實驗人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術、反應時間或溫度、試劑盒的儲存等。
5. 試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時請做好眼鏡、手、面部及衣服的防護。
6. 僅供科研使用，不可用于體外診斷。