Westernblotting是一個(gè)步驟繁多的實(shí)驗(yàn)，每一步都會(huì)對(duì)zui后的結(jié)果產(chǎn)生影響，電泳過程是其中關(guān)鍵重要的一步。好的電泳能讓目的條帶整齊，結(jié)果圖讓人眼前一亮。要做好電泳也并非易事，凝膠質(zhì)量在其中扮演著重要作用。電泳的支持介質(zhì)為聚丙烯酰胺凝膠，該凝膠的聚合由丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體在自由基的催化下完成。常用的催化聚合方法有兩種，分別為化學(xué)聚合法和光聚合法，實(shí)驗(yàn)室配制凝膠通常為化學(xué)聚合。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時(shí)甲叉雙丙烯酰...

預(yù)染marker易于使用–與上樣緩沖液預(yù)先混合，可直接凝膠上樣，無需煮沸。條帶清晰–亮度類似，但顏色不同的條帶便于觀察。質(zhì)量檢測(cè)–每批次均經(jīng)過SDS-PAGE和Westernblotting驗(yàn)證。兩個(gè)參考條帶–70kDa為橙色，10kDa為綠色。與膜兼容–Westernblotting時(shí)彩色條帶將轉(zhuǎn)移到膜上應(yīng)用，監(jiān)測(cè)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳期間蛋白的遷移。監(jiān)測(cè)Westernblotting蛋白轉(zhuǎn)移到膜上的情況。測(cè)定SDS聚丙烯酰胺凝膠和Westernblots上的蛋白分子量。...

絲裂原活化蛋白激酶MAPK（mitogen-activatedproteinkinase）是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)酶的活性，參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié)，并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。MAPK是一組能被不同的細(xì)胞外刺激，如細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。該通路的基本組成是一種從酵母到人類都保守的三級(jí)激酶模式，包括MAPK激酶激酶（MAPkinasekinasekinase，...

1.如何保存和分裝抗體？對(duì)于許多抗體而言，分裝為小等份在-20℃或-80℃下凍存是*的保存條件?？贵w保存應(yīng)避免反復(fù)凍融，分裝可以zui大限度減少凍融對(duì)抗體造成的損壞，還可避免多次從同一管中移取抗體而引入污染。但是每份不應(yīng)該少于10uL。分裝的體積越小，抗體的濃度受蒸發(fā)和管壁吸附的影響就會(huì)越大。大部分情況下，抗體在4℃條件下能夠保存1-2周。但有部分特例。為了防止微生物污染，可在抗體中加入適當(dāng)濃度的NaN3。如果要用抗體對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色或處理，或者要用抗體進(jìn)行體內(nèi)研究，則不能使...

BSA試劑重金屬(如Pb)：BSA試劑的基本信息，貨號(hào)：A8020規(guī)格：10g100g500g1000g別名：牛血清白蛋白(第五部分)；牛白朊(第五部分)；牛白蛋白；蛋白粉；BSAV；Albumin(bovinefractionV；BovinealbuminfractionⅤ;BovineserumalbuminfractionⅤ分子量：68Kd。外觀：類白色凍干粉。特性：純度（蛋白質(zhì)）：≥95%，水≤5%；均一化電泳檢測(cè)。雜質(zhì)：Na：BSA試劑可提高特異性的識(shí)別能力。在做w...

WB常用試劑使用可逆染色劑例如麗春紅S檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果，檢查轉(zhuǎn)膜操作是否正確。PVDF膜需預(yù)先浸在甲醇中，然后浸到轉(zhuǎn)移緩沖液中。代替5%脫脂奶粉，使用含0.5%脫脂奶粉或無脫脂奶粉的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少封閉時(shí)間。使用新鮮一抗，重復(fù)使用有效濃度會(huì)降低。在孵育和洗滌液中加入溫和去污劑如吐溫-20。脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，會(huì)結(jié)合磷酸化特異性抗體而易產(chǎn)生高背景。使用BSA代替奶粉作為封閉劑。WB常用試劑使用溫和的去污劑如吐溫-20，或更換封閉劑（常用的...

封閉的原理：固相載體表面(如elisa板，NC膜或者PVDF膜上等)有很多孔洞，通過電轉(zhuǎn)或包被，膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到了膜上，或抗原/抗體固定在板上，蛋白以機(jī)械填補(bǔ)(堆積)和吸附的方式結(jié)合于表面。蛋白塞進(jìn)了表面的很多孔洞里面，但蛋白并不是連續(xù)的，有很多空隙，而且比如說樣品孔之間也有空隙，這些孔洞并沒有填進(jìn)東西，而抗體也是蛋白，也會(huì)被吸附在空的洞里，這樣就會(huì)有很多非特異性的信號(hào)。封閉液中的蛋白可以與表面上的空白空洞位置結(jié)合，同樣以機(jī)械填補(bǔ)(堆積)和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜上，因?yàn)橛小?..

預(yù)染marker通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加3000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入6000個(gè)細(xì)胞。具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定。37℃5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)或按照實(shí)驗(yàn)具體需要進(jìn)行培養(yǎng)，一般培養(yǎng)6～24h。按照實(shí)驗(yàn)具體要求，給予0～20ml干預(yù)藥物處理，37℃5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)至合適時(shí)間。預(yù)染marker分子量范圍–10種蛋白分子量范圍在10到170kDa之間。易于使用–與上樣緩沖液預(yù)先混合，可直接凝膠上樣，無需煮沸。條帶清晰–亮度類似，但顏色不同的...