Fluo-8 AM免洗細(xì)胞鈣流檢測試劑盒

Fluo-8 AM免洗細(xì)胞鈣流檢測試劑盒組分和規(guī)格如下。建議Fluo-8細(xì)胞裝載試劑使用量96-孔板每孔100μL, 384-孔板每孔25μL。 96T，960T和9600T 可以分別完成1， 10和100塊96-孔或384-孔板的實驗。

1、根據(jù)實驗需要接種細(xì)胞于96-孔或384-孔底部透明黑色細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞培養(yǎng)基血清濃度不超過10%。根據(jù)實驗需要37℃ 5% CO2孵箱孵育一定時間。
2、取出Fluo-8 裝載緩沖液和QF（10x）試劑，平衡至室溫，充分混勻。
3、取出Fluo-8 AM，室溫溶化，離心收集內(nèi)容物于管底，置于冰上。如果Fluo-8 AM不是一次性用完，應(yīng)進(jìn)行分裝，-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。
4、按每孔加入和孔內(nèi)培養(yǎng)基等體積的Fluo-8細(xì)胞裝載試劑計算所需Fluo-8細(xì)胞裝載試劑用量
5、Fluo-8細(xì)胞裝載試劑配制：將10x QF試劑按10倍稀釋加入Fluo-8裝載緩沖液中，例如1mL 10x QF試劑加入9mL Fluo-8裝載緩沖液中, 充分混勻。Fluo-8 AM 為 400X, 按1X加入上述配制的Fluo-8裝載緩沖液(含1x QF)，此為Fluo-8細(xì)胞裝載試劑。
6、某些細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞，需要在Fluo-8細(xì)胞裝載試劑中加入丙磺shu（Probenecid，CAS：57-66-9）以抑制細(xì)胞將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Fluo-8轉(zhuǎn)運出細(xì)胞。丙磺shu由客戶自己提供，建議加入Fluo-8細(xì)胞裝載試劑的丙磺shu終濃度為2.5mM。對不同的細(xì)胞，最佳濃度可能需要優(yōu)化。 
丙磺shu配制：用 1N NaOH 配制為500 mM 原液，使用前先用1X HBSS 緩沖液稀釋為250 mM后加入Fluo-8細(xì)胞裝載試劑中，終濃度為2.5mM. (HBSS 緩沖液由客戶自己提供，配方為20 mM HEPES buffer pH7.4 + 1X Hank's Balanced Salt Solution, pH 7.4)。
7、標(biāo)準(zhǔn)方法檢測：加入和細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)培養(yǎng)基等體積的Fluo-8細(xì)胞裝載試劑，例如96-孔板每孔100μL培養(yǎng)基加入100μL Fluo-8細(xì)胞裝載試劑。
（可選檢測方法：含有10% FBS的培養(yǎng)基可能會降低讀值和增加背景，可以去除孔內(nèi)培養(yǎng)基，按1：1混合Fluo-8細(xì)胞裝載試劑（步驟5和6配制）和HBSS緩沖液，加入相當(dāng)于2倍體積原培養(yǎng)基的此混合液檢測。或使用低濃度FBS的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，按步驟7標(biāo)準(zhǔn)方法檢測。)
8、37℃ 孵育 1小時。具體孵育溫度（例如室溫或37℃）和時間（0.5hr-2hr或更長）需根據(jù)具體實驗優(yōu)化。
9、進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鈣流檢測：根據(jù)實驗需要和檢測設(shè)備進(jìn)行檢測參數(shù)設(shè)置，加入測試化合物，底部讀數(shù)檢測熒光強度。適用檢測設(shè)備包括FlexStation, FLIPR（Molecular Devices ）等。其中FlexStation 3 用Ex/Em = 485/525 nm讀取熒光。

1、不同批次不建議混用。
2、非經(jīng)驗證，不建議改變檢測試劑用量。